大鼠不同程度腦損傷模型

大鼠不同程度腦損傷模型

(1)復(fù)制方法  健康雄性大鼠，體重為230～260g。采用改進(jìn)的Feeney自由落體硬膜外撞擊方法。損傷裝置由底板、固定支架、垂直導(dǎo)桿、下落和聚乙烯撞擊圓錐組成。撞擊圓錐頭端直徑為4mm、高為2.5mm。經(jīng)腹腔注射水合氯醛(按350～400mg/kg體重的劑量)或戊丨巴丨比丨妥丨鈉(按50～60mg/kg體重的劑量)麻醉。將其頭部固定于立體定向儀上，剪去頂部毛發(fā)，手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。沿中線左側(cè)切開(kāi)頭皮，分離骨膜，用牙科鉆于中線旁2mm、緊挨冠狀縫后開(kāi)一直徑5mm的圓形窗，硬膜保持完整。用20g砝碼于10cm和30cm高處通過(guò)一金屬導(dǎo)桿墜落，撞擊置于硬膜上的圓錐上致輕、中型損傷，另用40g砝碼于25cm高處墜落致重型損傷。輕、中、重三型損傷的致傷沖擊力分別為200g·cm、600g·cm和1000g·cm，用鋅汀粉封閉骨窗，縫合頭皮，置鼠籠喂養(yǎng)。

(2)檢測(cè)指標(biāo)

1)腦含水量測(cè)定  動(dòng)物斷頭處死后，30s內(nèi)取出大腦，用濾紙吸盡腦表面血丨漬后，銳性分離左側(cè)頂葉皮質(zhì)約100mg，用電子分析天平稱濕重后，置于110℃恒溫干燥箱內(nèi)烤干(24h)，稱干重。用Elliot公式計(jì)算各部位腦含水量百分率：

腦含水量(％)＝[(濕重－干重)/濕重]×比率

2)血腦屏障定量測(cè)定  動(dòng)物于損傷前1h注射2％伊文斯藍(lán)(3ml/kg體重)。在取腦組織前，為清除血液中染料，可用生理鹽水經(jīng)左心室灌注至右心室流出清亮液體為止。取損傷側(cè)皮質(zhì)分別稱重，加入二倍體積的二甲基甲酰胺，50℃水浴中孵育72h，1500g離心，離心10min，取上清液。應(yīng)用分光光度計(jì)在伊文斯藍(lán)大吸收光譜635mm處檢測(cè)吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得伊文斯藍(lán)含量，結(jié)果以μg/g腦組織表示。

3)病理學(xué)觀察  損傷后24h再次麻醉，經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注生理鹽水150ml，繼之快速灌注冰冷的4％多聚甲醛200ml，隨后再用其300ml在2h內(nèi)慢速灌注，取腦組織浸入4％多聚甲醛內(nèi)4℃后固定48h，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，行5μm冠狀切片，作HE染色及尼氏小體染色，光鏡下觀察。若采用透射電鏡觀察者，灌注液為4％多聚甲醛和2％戊二醛/0.1MPB(pH7.4)，隨后浸入2％戊二醛/0.1MPB(pH7.4)內(nèi)，4℃固定過(guò)夜。常規(guī)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，醋酸鉛鈾染色，透射電鏡觀察。

(3)模型特點(diǎn)

1)腦含水量變化  輕型腦損傷傷后30min，傷側(cè)腦皮質(zhì)含水量開(kāi)始升高，3h顯著升高，24h達(dá)高峰，為80％左右。72h含水量有所降低，至損傷后168h腦含水量恢復(fù)正常。中型腦損傷傷后15min，傷側(cè)皮質(zhì)含水量即已升高，30min顯著升高，6h達(dá)高峰，也為80％左右，持續(xù)至24h。至168h含水量基本恢復(fù)正常。重型腦損傷傷后其傷側(cè)皮質(zhì)含水量于傷后15min明顯升高，傷后3～6h達(dá)高峰，持續(xù)至72h。傷后168h腦含水量仍高于正常對(duì)照值。

2)血腦屏障定量測(cè)定  腦損傷后血腦屏障通透性明顯增高，并隨損傷程度的加重而加重。在損傷15min后，損傷側(cè)皮質(zhì)伊文斯藍(lán)含量就明顯增高，輕、中型于6h達(dá)高峰，重型者3h達(dá)高峰，24h開(kāi)始下降。

3)組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)改變

①光鏡觀察  輕型損傷后24h光鏡觀察，見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)水腫，尼氏小體染色變淺，微血管外間隙擴(kuò)大；中型損傷后24h，神經(jīng)細(xì)胞周?chē)[，微血管外間隙增大更為明顯；重型損傷后24h，皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞周?chē)[明顯，尼氏小體染色明顯變淺，微血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，管腔狹窄更加明顯。

②透射電鏡觀察  輕型損傷傷后24h，傷側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體明顯腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張。神經(jīng)細(xì)胞周?chē)窠?jīng)氈腫脹，微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞飲小泡增多、腫脹、管腔狹窄。膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)水腫改變，特征同神經(jīng)細(xì)胞，但改變較輕微；中型損傷后24h神經(jīng)細(xì)胞線粒體及神經(jīng)氈空泡樣變，微血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹及管腔狹窄明顯；重型損傷傷后24h，絕大部分神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)到空泡樣變的少數(shù)線粒體及高度擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。細(xì)胞核染色質(zhì)邊聚，染色變淡，核膜皺縮。神經(jīng)氈空泡樣變。微血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹更加明顯，胞飲增多，管腔明顯狹窄。

(4)比較醫(yī)學(xué)  此模型為自由落體腦損傷，屬機(jī)械性損傷，類似臨床上的加速傷。由于損傷部位局限，所造成的局部腦損傷性質(zhì)與臨床上見(jiàn)到的腦挫裂傷相似。該模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：①損傷機(jī)制單一便于定性研究。②方法簡(jiǎn)單，條件易于控制，采用自由落體打擊法，可根據(jù)需要控制高度和重量。③致傷程度較一致，重復(fù)性好。④腦水腫性質(zhì)與臨床上創(chuàng)傷性腦水腫相似，定量準(zhǔn)確。⑤實(shí)驗(yàn)對(duì)象采用大鼠，價(jià)廉、抗病、便于大批定量研究和長(zhǎng)時(shí)間觀察。

此方法也可采用小鼠和新西蘭白兔。小鼠：將小鼠固定在自由落體腦損傷裝置的底部平臺(tái)上，用直徑約4mm的撞頂在小鼠顱骨矢狀面左側(cè)2～4mm處，取50g砝碼，從15cm高處自由落下，通過(guò)撞造成閉合性腦外傷模型動(dòng)物。兔子：于頭頂部正中矢狀位切開(kāi)至顱骨表面，分離兩旁軟組織，微型鉆頭在右頂骨上四點(diǎn)鉆孔。線鋸鋸開(kāi)骨橋，在右頂骨上形成直徑為1.5cm×1.5cm的方形骨窗。置入打擊墊于硬膜外，用800g·cm的打擊能量使腦組織造成挫裂傷。還納骨瓣，骨縫用醫(yī)用EC膠封閉，縫合頭皮。