1. 冷凍保種實驗服務內容概述
A. 適用樣本類型
微生物:細菌(如大腸桿菌、乳酸菌)、酵母(如畢赤酵母)、絲狀真菌、噬菌體等。
細胞系:哺乳動物細胞(如HEK293、HeLa)、干細胞、原代細胞等。
特殊樣本:難培養微生物(如厭氧菌)、基因編輯菌株(如CRISPR改造菌)。
B. 服務項目
項目 | 描述 |
---|---|
標準凍存 | 使用甘油或DMSO凍存液,-80℃或液氮保存。 |
優化凍存方案 | 針對脆弱菌種(如支原體)定制凍存保護劑。 |
復蘇驗證 | 凍存后復蘇,檢測存活率、污染及功能(如質粒保留、基因表達)。 |
庫存管理 | 提供條形碼標簽、電子數據庫記錄(凍存時間、位置、基因型等)。 |
快遞運輸 | 干冰或液氮罐運輸凍存管,確保全程低溫。 |
2. 冷凍保種實驗服務技術流程
A. 標準凍存步驟(以大腸桿菌為例)
前處理:
培養至對數生長期(OD600≈0.6-0.8)。
離心收集菌體,去除殘留培養基(避免冷凍損傷)。
凍存液制備:
常用保護劑:15-30%甘油(細菌)或10% DMSO(哺乳細胞)+培養基。
特殊配方:如海藻糖(提高真菌存活率)。
分裝與標記:
分裝至凍存管(推薦1.5 mL螺口凍存管),標注菌株名稱、日期、濃度。
冷凍程序:
梯度降溫:4℃ 30 min → -20℃ 1 h → -80℃長期保存(或直接液氮氣相)。
程序冷凍儀:精確控制降溫速率(如1℃/min,適用于敏感細胞)。
液氮保存:
轉移至液氮罐(氣相:-150℃至-196℃),避免液相中管爆裂。
B. 復蘇驗證
快速解凍(37℃水浴,<1 min)。
涂板或液體培養,檢測:
存活率(CFU計數 vs 凍前)。
遺傳穩定性(PCR驗證目標基因、質粒保留率)。
污染檢測(無抗生素平板培養、16S rRNA測序)。
3. 關鍵注意事項
A. 提高存活率的策略
保護劑優化:
細菌:甘油濃度需匹配菌種(如乳酸菌需20%甘油+5%脫脂奶粉)。
細胞:血清替代物(如HyClone FBS)減少批次差異。
冷凍速率:
快速冷凍(直接-80℃)適合多數細菌,慢速冷凍(程序降溫)適合真核細胞。
B. 避免常見問題
問題 | 原因 | 解決方案 |
---|---|---|
復蘇后無生長 | 保護劑濃度不當或凍存液未混勻 | 重新優化保護劑,渦旋混勻后再凍存。 |
細胞破裂 | 冰晶形成(降溫過慢) | 添加冷凍保護劑(如DMSO),程序降溫。 |
污染(真菌/支原體) | 凍存前樣本不純或操作污染 | 凍存前抗生素處理、PCR檢測。 |
4. 用戶常見問題(FAQ)
Q1:凍存菌種能保存多久?
-80℃:細菌通常2-5年,酵母1-3年(定期復蘇驗證)。
液氮:>10年(需避免溫度波動)。
Q2:如何運輸凍存菌種?
干冰運輸:維持-78℃,適合短期(<3天)。
液氮罐:長期運輸需專業容器(如Taylor-Wharton液氮罐)。
Q3:凍存后基因會突變嗎?
風險較低,但建議:
保存早期傳代菌株(避免累積突變)。
關鍵菌株備份多管(避免反復凍融)。
6. 延伸服務
菌種鑒定:16S rRNA測序、MALDI-TOF質譜分析。
專l保藏:協助提交至中國典型培養物保藏中心(CCTCC)或ATCC。