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      KO小鼠模型構建

      KO小鼠模型構建

      簡要描述:
      KO小鼠模型構建:基因敲除(Knockout, KO)小鼠是研究基因功能的核心工具,通過完quan或條件性刪除目標基因,模擬人類疾病或探索基因機制

      更新時間:2025-06-26

      訪問量:35

      廠商性質:其他

      一、KO小鼠模型構建技術路線選擇

      方法周期成本適用場景優勢/劣勢
      CRISPR-Cas92-4個月低至中簡單敲除、短片段插入快、成本低,但可能脫靶
      ES細胞同源重組6-12個月復雜修飾(如條件性KO、大片段替換)精準,但周期長、需顯微操作
      Base Editing3-5個月中至高單堿基敲除(無DSB)避免雙鏈斷裂,但效率較低

      二、KO小鼠模型構建CRISPR-Cas9 方案(當前常用)

      1. 設計gRNA
      • 靶點選擇

        • 針對目標基因的外顯子(優先選擇首ge編碼外顯子)。

        • 使用在線工具(如Benchling或CRISPR Design)避免脫靶。

      • 合成gRNA:化學合成或體外轉錄(需加5'端G增強轉錄效率)。

      2. 構建打靶載體(可選)
      • 供體DNA:若需同時插入報告基因(如GFP),需設計同源臂(~800 bp)。

      3. 受精卵注射
      • 注射混合物

        • Cas9 mRNA(50 ng/μL) + gRNA(25 ng/μL) ± 供體DNA(100 ng/μL)。

      • 胚胎操作

        • 注射C57BL/6或BALB/c品系受精卵(原核期)。

        • 移植至假孕母鼠子宮(約30個胚胎/母鼠)。

      4. 基因型鑒定
      • F0代篩查

        • PCR + 測序:檢測Indel突變(引物設計在gRNA靶點外)。

        • T7E1或Surveyor assay:快速檢測切割效率。

      • 傳代驗證:F0可能為嵌合體,需與野生型交配獲得F1雜合子。

      5. 表型分析
      • 完quanKO驗證:qPCR/Western blot確認基因表達缺失。

      • 表型檢測:根據基因功能設計(如代謝、行為學、病理分析)。


      三、ES細胞打靶方案(傳統方法)

      1. 靶向載體構建
      • 同源臂:5'和3'臂各1.5-3 kb, flanking 目標外顯子。

      • 篩選標記:NeoR(正選擇)和TK(負選擇,如HSV-TK)。

      2. ES細胞轉染與篩選
      • 電轉遞送:將線性化載體轉入JM8或E14 ES細胞。

      • 藥物篩選:G418(NeoR) + 更xi洛韋(TK陰性篩選)。

      3. 囊胚注射與嵌合體獲得
      • 顯微注射:將陽性ES細胞注入C57BL/6囊胚。

      • 嵌合體鑒定:毛色嵌合(如129 ES細胞→B6母鼠)。

      4. 生殖系傳遞
      • 嵌合體(公鼠)與野生型交配,篩選后代基因型。


      四、條件性KO(cKO)附加步驟

      1. 設計floxed小鼠

        • 在目標外顯子兩側插入loxP位點(需同源重組或CRISPR-HDR)。

      2. 與Cre小鼠交配

        • 選擇組織特異性Cre品系(如Alb-Cre用于肝臟敲除)。

      3. 驗證敲除效率

        • 在目標組織中檢測基因缺失(避免全身性表型干擾)。


      五、常見問題與解決方案

      問題原因解決方案
      F0無突變gRNA效率低或Cas9活性不足優化gRNA設計,提高注射濃度
      嵌合體不傳代ES細胞貢獻不足改用高貢獻率ES細胞系(如JM8A3.N1)
      非預期表型脫靶效應或相鄰基因影響多獨立品系驗證,全基因組測序排查
      條件性KO不完quanCre表達效率低換用強效Cre品系(如UBC-CreERT2)


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